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液相色譜柱的選擇方法概述

更新時(shí)間:2019-12-10點(diǎn)擊次數(shù):3150

液相色譜柱的選擇方法概述

選擇方法一:填料的種類(lèi)

填料的基質(zhì)一般選擇使用多孔硅膠或聚合物等,在細(xì)孔的表面有多種經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的官能團(tuán)。

利用目標(biāo)成分疏水性的不同起到分離效果的反相分離模式,利用極性不同進(jìn)行分離的正相分離模式,根據(jù)分子大小的不同而分離的尺寸排阻模式,根據(jù)離子性質(zhì)的不同而達(dá)到分離的離子交換模式,又或者分離光學(xué)異構(gòu)體等,根據(jù)目的的不同,需要

選擇對(duì)應(yīng)的填料。

作為填充劑的代表十八烷基、辛基、丁基等即在硅膠的細(xì)孔表面化學(xué)鍵合的 C18(ODS)、C8 或 C4 等,碳鏈越長(zhǎng),疏水性(保留能力)越強(qiáng)。

 

選擇方法二:填料孔徑

多孔硅膠為基體的填料表面具有無(wú)數(shù)的細(xì)孔,需要根據(jù)目的成分的分子量選擇對(duì)應(yīng)大小的填料孔徑。微孔徑 100Å(10nm)對(duì) 應(yīng) 5000 左右 的 分 子 量。 分 子 量 大 于 5000 的, 可 以 選 擇300Å(30nm)或以上的大孔徑柱子。目的成分能夠進(jìn)入孔的話(huà),才能與官能團(tuán)相互作用從而起到分離的效果。對(duì)于大分子蛋白質(zhì)或聚合物等高分子,如果不是大孔徑的基體,與官能團(tuán)的相互作用就會(huì)減少。另外,分析低分子時(shí),選擇太大的微孔,由于會(huì)擴(kuò)散故導(dǎo)致峰型可能會(huì)展寬。

 

選擇方法三:填料粒徑

一般 HPLC 多使用粒徑為 5μm 的球狀硅膠,近年來(lái)也逐步開(kāi)始使用 2μm 以下的微粒子,粒徑越小色譜柱理論塔板數(shù)就越高,得到峰型也就越尖銳,分離越好。而且,粒徑越小,即使流速上升,理論塔板數(shù)降低很少,微粒子色譜柱越來(lái)越適合快速分析。但是,微粒子使用時(shí),必須注意使用壓力。3μm 以下適合UHPLC快速分析,3 ~ 5μm 適合一般的 HPLC 柱分析,10μm 則作為制備 HPLC 柱使用。

 

選擇方法四:色譜柱尺寸 (長(zhǎng)度)

一般使用較多的色譜柱的長(zhǎng)度,通用型,制備 HPLC 柱長(zhǎng)度為150 ~ 250mm,LC/MS 為 100-150mm,超快速 HPLC(UHPLC)為 50-100mm。色譜柱長(zhǎng)度越長(zhǎng)理論塔板數(shù)也越高。只是,需要注意,色譜柱長(zhǎng)度加倍后,分析時(shí)間與使用壓力也會(huì)加倍。

對(duì)于 2μm 或者 3μm 的微粒子,分離度和理論塔板數(shù)都較好時(shí),將色譜柱的長(zhǎng)度變短,可以縮短分析時(shí)間,進(jìn)行快速分析。

 

選擇方法五:色譜柱尺寸 (內(nèi)徑)

一般通用的 HPLC 柱內(nèi)徑為 4.6mm,LC/MS 內(nèi)徑多為 2.1mm,毛細(xì)管 HPLC 色譜柱為不滿(mǎn) 1mm,制備 HPLC 色譜柱6.0mm 以上。通用 HPLC 系列,內(nèi)徑不同得到的結(jié)果也不同。即使改變內(nèi)徑,根據(jù)色譜柱的截面積比改變相應(yīng)的流速,保留時(shí)間基本不會(huì)改變。特別是對(duì)于像 UV、RI 一樣對(duì)于濃度要求很高的檢測(cè)器而言,流速越小,其對(duì)應(yīng)的靈敏度也越高。需要注意的是,通用型 HPLC 色譜柱內(nèi)徑太小,裝置的死體積(管路內(nèi)多余的配管或者流通池容量)影響變大,峰型會(huì)變寬。并且根據(jù) HPLC 系統(tǒng)使用目的的不同(分析、制備、毛細(xì)管等)種類(lèi)也不同,能夠設(shè)定的正確的流速與流速范圍,系統(tǒng)響應(yīng)等也會(huì)不同,所以根據(jù)系統(tǒng)不同選擇對(duì)應(yīng)的內(nèi)徑是十分重要的。

 

選擇方法六:端基封尾

端基封尾是硅膠表面有一種被稱(chēng)為硅醇基的弱酸性官能團(tuán)(Si-OH)存在。作為反相分配填料等合成時(shí),利用硅醇基對(duì)十八烷基(ODS:C18)進(jìn)行化學(xué)鍵合。然而,部分沒(méi)有鍵合殘留的硅醇基會(huì)與堿性化合物吸附,引起峰拖尾。為了防止這種現(xiàn)象,使用甲基等短鏈基團(tuán)對(duì)殘存硅醇基進(jìn)行處理,這個(gè)過(guò)程就稱(chēng)作端基封尾。選擇 ODS 色譜柱時(shí),請(qǐng)選擇進(jìn)行端基封尾的柱子。下述作為參考,反相色譜柱的一些相互作用。

 

相互作用的類(lèi)型:

◆疏水性相互作用

疏水性高的物質(zhì)之間會(huì)有相互牽引作用,與相似相溶道理一樣,填料結(jié)合基團(tuán)的碳鏈(烷基鏈)越長(zhǎng)疏水性越高。

◆離子性相互作用

在反相分析中,弱酸性的硅醇基能與堿性化合物結(jié)合,與酸性化合物會(huì)發(fā)生排斥,會(huì)對(duì)峰型及保留時(shí)間有影響。更適合使用端基封尾處理的柱子或者調(diào)節(jié)溶劑的 PH 值,抑制這種作用。

◆氫鍵

氫原子易與電負(fù)性高的原子發(fā)生結(jié)合,如與氧、氮、硫、鹵素以及芳香環(huán)的 π 電子等作用。

◆π 電子相互作用

像苯環(huán)這類(lèi)具有 π 電子結(jié)構(gòu)的化合物,相互之間會(huì)有電子吸引作用。像苯基柱這類(lèi)具 π 電子作用的柱子,對(duì)于目標(biāo)物的 π 電子具有選擇性,通過(guò)此相互作用起到分離效果。

◆金屬配位吸附

填充劑硅膠基質(zhì)內(nèi)會(huì)含有部分殘留的金屬,故易會(huì)引起配位化合物的吸附現(xiàn)象。而且,解離的硅醇基與金屬離子一旦發(fā)生配位,會(huì)發(fā)生峰拖尾或者目的成分不能被洗脫的狀況。

 

選擇方法七:色譜柱接頭形式

HPLC 色譜柱的接頭根據(jù)廠家的不同也會(huì)有不同。一般分析色譜柱是 1/16 英寸外徑的管子使用螺絲進(jìn)行連接,若連接不同的接口,較易產(chǎn)生死體積與漏液現(xiàn)象。

特別對(duì)于不銹鋼的配管等,需用套圈固定管子,就必須選擇對(duì)應(yīng)的接口形式。

接口形式和螺距有英寸螺距和毫米螺距兩種。一般 Waters 接口型使用比較普遍。無(wú)論是 HPLC 或 UHPLC,通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)纳V柱接口形式,InertSustain 以及 Inertsil 的性能能夠充分的發(fā)揮(標(biāo)準(zhǔn)接口為 Waters 接口型)。

 

選擇方法八:經(jīng)常使用的色譜柱規(guī)格

◆HPLC 分析

5μm, 150×4.6mm I.D.

5μm, 250×4.6mm I.D.

◆UHPLC, LC/MS 分析

2μm, 50×2.1mm I.D.

2μm, 100×2.1mm I.D.

3μm, 75×2.1mm I.D.

◆LC/MS 分析

3μm, 100×2.1mm I.D.

3μm, 150×2.1mm I.D.

5μm, 150×2.1mm I.D

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